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外泌体整体服务

外泌体（Exosome）是一种由细胞分泌的膜性囊泡小体，其直径通常为30-100nm，比其它的一些囊泡（凋亡小体）要小得多。外泌体广泛存在于各种体液中，可携带蛋白质、脂类、核酸（miRNAs，ncRNAs）等多种生物功能大分子。新的研究表明，外泌体形成了一种特殊的细胞间信息传递系统，它不仅影响细胞的生理状态，而且还与多种疾病的发生与发展密切相关。外泌体领域的研究已经在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用，基于质谱的高通量蛋白质组学是研究外泌体不可或缺的一项技术手段。

外泌体具有磷脂双分子膜结构，导致其沉降系数和蛋白质聚集体有着很大的不同。而且外泌体膜表面存在特异性膜蛋白如CD9和CD81，前者被证实和肿瘤迁移有关，后者与丙型肝炎病毒的侵染有关。而因为外泌体具有这些显著的易分离的特点，我们可以通过密度梯度离心，亲和层析等方法对外泌体进行分离和纯化。

1.    外泌体提取-800元/样本

超速离心是从生物体液或细胞上清分离外泌体的金标准方法。采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。目前在国内外普遍应用的经典技术手段。

一、技术简介：

外泌体（Exosomes）是一种直径在30-200 nm的微小囊泡，可由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA,参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。

目前外泌提取主要有超速离心、过滤离心、试剂盒提取等方法。其中超速离心分离得到外泌体，纯度高，得率大，可满足于后续不同实验的需求。本公司具备贝克曼的超高速离心机，随到随分，效率高，质量有保证

二、服务流程：

培养上清样本：

1. 培养液收集（干冰保存运输）。

2. 低速离心去除细胞、碎片及杂质。

3. 超速离心获得外泌体沉淀。

4. 外泌体纯化。

5.BCA法检测外泌体浓度。

6.提供实验报告。

血清/血浆样本：
1. 分离得到血浆/血清（血清血浆干冰保存运输，全血抗凝冰袋运输）。

2.低速离心去除碎片及杂质。
3. 超速离心获得外泌体沉淀。
4. 外泌体纯化。
5. BCA法检测外泌体浓度。
6. 提供实验报告。

三、结果形式：

1. 客户提供：血清或血浆（3-5ml）;培养基（50-100ml），或委托我公司代为培养收集细胞上清

2.公司提供：基本实验步骤、图片、数据分析结果。

3.实验周期：3个工作日

4.仪器设备：超高速离心机（品牌：BECKMAN    型号：Optima XPN-100）

2.     外泌体粒径检测-500元/样本

一、技术简介：

纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle TrackingAnalysis, NTA）是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度，检测10nm–1000nm 范围内的颗粒。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一；相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。

二、服务流程：

1. 客户提供外泌体（干冰运输）

2.外泌体粒径检测。
3. 提供实验报告。

三、结果形式：

1. 客户提供：外泌体（30ul-50ul）

2.公司提供：基本实验步骤、图片、数据分析结果。

3.实验周期：3个工作日

仪器设备：马尔文纳米颗粒跟踪分析仪Nanosight NS300

3.     外泌体透射电镜鉴定-1000元/样本

一、透射电镜检测外泌体原理：

双层囊膜结构（茶托状）是外泌体重要标志之一，但普通光学显微镜难以观察到此种亚显微结构。而透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM) 分辨率可达0.1 -0.2 nm，可将被观察物体放大至数百万倍，是外泌体双层囊膜超微结构观测的经典方法。

二、服务流程：

1.外泌体戊二醛固定（冰袋运输）。

2.外泌体电镜制样。

3.上机观察。

4.提供实验报告。

三、实验流程：

1. 客户提供：外泌体（30-50 μl）。
2. 公司提供：实验步骤，实验报告和原始图片。
3. 实验周期：2-3周。

4.仪器设备：透射电子显微镜 FEITecnai G2 Spirit

4.外泌体WB鉴定

外泌体（Exosome）主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，针对外泌体的定性检测，至少选择2-3个指标就能满足文章发表要求。本公司提供外泌体标记蛋白检测和相关抗体

5.     外泌体荧光标记-3000元/样本

1.    亲脂性染料:PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

2. 亲脂性羰花青染料（carbocyaninedyes）:DiI/DiD/DiO/DiR

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。

6. 外泌体RNA测序

送样要求：

1）血浆样本采集：EDTA抗凝管采集患者血液，若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过4 h）；将采集到的血液在4℃下1500 g，离心20min，去除血液中的细胞；取上清，4℃下3000 g，离心15min，收集上清（血浆），-80℃保存。送样量：   4mL

注意事项：1. 请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放； 2. 请排除乙肝病毒，HIV等病毒感染样本。

2）血清样本采集：用促凝管采集患者血液，若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过4 h）；将采集到的血液在4℃下1500 g，离心20min，去除血液中的细胞；

取上清，收集上清（血清），-80℃保存。送样量： 4 mL 注意事项：1. 请排除乙肝病毒，HIV等病毒感染样本。

3）尿液样本采集：采集前/中后段晨尿约60 mL，若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；将采集到的尿液在4℃下（室温亦可）离心2000 g，20 min，去除尿液中的细胞；-80℃保存。送样量：60 mL。

注意事项：请务必嘱咐患者，i)采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；ii)中段尿请务必去掉最初排出的50-80 mL尿液；iii）女性受试者，请于采尿前对外阴进行清洗。

4）胸水样本采集临床收集胸水后若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；将收集到的胸水1000 g离心10 min，收集上清液；将得到的胸水上清3000 g离心10min，收集上清，-80℃保存。送样量：30 mL

5）腹水样本采集临床收集腹水后若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；将采集到的腹水在4℃下（室温亦可）离心2000 g，20min，去除腹水中的残渣；-80℃保存。送样量：30 mL。

6）脑脊液样本采集采集方式为腰椎穿刺，样本一经分离，请务必立即置于冰上或4℃短暂保存（不得超过4 h），采样时注意避免血液污染；样本室温下2000 g离心20min去除细胞及部分碎片，取上清，-80℃保存。送样量：5 mL 注：请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放。

7）胆汁样本采集用无菌容器收集胆汁；将收集到的胆汁在4℃下，3000 g离心10 min去除细胞沉渣和碎片；收集胆汁上清液，4℃或者-20℃长期保存。送样量：5 mL

8）细胞上清样本采集

对于耐受无血清培养的细胞的处理流程：对于贴壁细胞汇合密度在70%以上，用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清，添加无血清培养基，继续培养24小时。细胞上清先用200-300g离心10min，再用3000g离心10min，最后0.22um过膜或者10000g离心30min。储存运输：将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶，-80保存或者干冰运输，体积需求细胞上清原液大于100ml .对于一些状态良好的细胞上清，少至70ml，也可以得到较好的外泌体分离结果。

对于不耐受无血清培养的细胞的处理流程：对于贴壁细胞汇合密度在70%以上，用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清，添加含5%无外泌体血清的培养基，继续培养24小时。细胞上清先用200-300g离心10min，再用3000g离心10min，最后0.22um过膜或者10000g离心30min。将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶，-80保存或者干冰运输，体积需求细胞上清原液大于100ml.对于一些状态良好的细胞上清，少至70ml，也可以得到较好的外泌体分离结果。送样量：细胞上清原液建议大于100 mL。